ในฟังก์ชั่นการทำงานที่ทันสมัยการทำความเข้าใจว่ายีนที่เฉพาะเจาะจงควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ได้อย่างไรทั้งการแทรกแซงเป้าหมายและการวิเคราะห์ในความละเอียดสูง นี่คือสิ่งที่ Perturb-seq มาเป็นวิธีการหนึ่งที่รวมการสั่งซื้อซ้ำของ CRISPR กับการจัดลำดับเซลล์ RNA เดี่ยว (SCRNA-seq) เพื่อทำแผนที่การทำงานซ้ำกับระบบชีวภาพที่ซับซ้อน
โดยการรวมการแก้ไขจีโนมที่แม่นยำเข้ากับการทำโปรไฟล์การถอดเสียงนักวิจัย Perturb-seq ช่วยให้นักวิจัยสามารถตรวจสอบว่าการลดลงหรือการตียีนเฉพาะส่งผลกระทบต่อเซลล์แต่ละเซลล์ภายในประชากรที่ต่างกัน
Perturb-seq คืออะไร?
ในแกนกลางของมัน Perturb-seq ใช้สองเทคโนโลยีที่ทรงพลัง:
- ความผิดปกติของยีน CRISPR/CAS9: แนะนำการแก้ไขเป้าหมายหรือการกดขี่ (CRISPRI) ของยีนที่เลือก
- การจัดลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยว (scRNA-seq): การจับโปรไฟล์การถอดเสียงการถอดเสียงจากเซลล์แต่ละเซลล์หลายพันเซลล์
นวัตกรรมที่สำคัญที่สุดคือการใช้ระบบบาร์โค้ด คู่มือ CRISPR แต่ละ RNA เชื่อมโยงกับหลังคาโมเลกุลที่เป็นเอกลักษณ์ หลังจากการรบกวนบาร์โค้ดเหล่านี้จะถูกจัดลำดับพร้อมกับการถอดเสียงของเซลล์ทำให้นักวิจัยสามารถจับคู่โปรไฟล์การแสดงออกของยีนของแต่ละเซลล์ด้วยการรบกวนเฉพาะที่ได้รับ
วิธีการทำงานของ Perturb-seq: ภาพรวมทีละขั้นตอน
- คู่มือการออกแบบของห้องสมุด: นักวิจัยออกแบบห้องสมุด RNA CRISPR แบบครบวงจรที่มีเป้าหมายเป็นสิ่งที่น่าสนใจ
- การถ่ายทอดเซลล์: ไลบรารีคู่มือถูกนำมาใช้ในเซลล์โดยทั่วไปผ่านการถ่ายทอด lentiviral
- การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรบกวน: เซลล์เติบโตภายใต้เงื่อนไขการทดลองช่วยให้การแก้ไขยีนหรือการยับยั้งยีน CRISPR-mediated มีผล
- การบันทึกและการจัดลำดับเซลล์เดี่ยว: แต่ละเซลล์ถูกแยกโดยใช้แพลตฟอร์มเช่น 10x Genomics และทั้งการถอดเสียงและบาร์โค้ดคู่มือได้รับการจัดลำดับ
- การรวมข้อมูล: การวิเคราะห์ทางชีวภาพตรงกับรหัสการก่อกวน DASH กับข้อมูลบทกวีการถอดเสียงซึ่งเผยให้เห็นความสัมพันธ์ของฟังก์ชั่นของยีนในประชากรเซลล์
ทำไม Perturb-seq จึงมีความสำคัญ
Perturb-seq เชื่อมหลุมที่สำคัญในจีโนมที่ใช้งานได้: การศึกษาฟังก์ชั่นยีนในขณะที่ยังคงรักษาสารละลายเซลล์เดี่ยว หน้าจอ CRISPR แบบดั้งเดิมวัดผลลัพธ์จำนวนมาก – เช่นการอยู่รอดของเซลล์หรือการเปิดใช้งานนักข่าว – โดยไม่ต้องจับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนที่เหมาะสม
ด้วยนักวิทยาศาสตร์ที่ก่อกวน -Seq สามารถ:
- เปิดเผยกะการถอดเสียงที่ละเอียดอ่อน: บันทึกการเปลี่ยนแปลงที่ไม่จำเป็นต้องส่งผลกระทบต่อความมีชีวิตของเซลล์
- โปรไฟล์ชนิดเซลล์ต่างกัน: ใช้หน้าจอกับประชากรผสมแยกแยะเอฟเฟกต์ข้ามเซลล์ที่แตกต่างกัน
- เครือข่ายสั้น -ควบคุม: ระบุเส้นทางดาวน์สตรีมที่ได้รับผลกระทบจากการหยุดชะงักอีกครั้ง
การรวมกันของ Perturb-seq กับรังสีอื่น ๆ
Perturb-seq มักจะรวมเข้ากับเวิร์กโฟลว์ที่กว้างขึ้นด้วยเซลล์เดียว ตัวอย่างเช่นการจับคู่จะช่วยให้มันมี Cite-seq พร้อมกันวัด RNA พร้อมกันการแสดงออกของโปรตีนและความผิดปกติของ CRISPR วิธีการเลเยอร์นี้ช่วยเชื่อมต่อผลลัพธ์การแก้ไขยีนไม่เพียง แต่กับระดับ mRNA เท่านั้น แต่ยังรวมถึงตัวบ่งชี้โปรตีนพื้นผิวโดยเฉพาะอย่างยิ่งมีประโยชน์ในการวิจัยภูมิคุ้มกันวิทยาและการวิจัยมะเร็ง
การใช้ Perturb-seq จริงๆ
นักวิจัยใช้ Perturb-seq ในสาขาเช่น:
- ชีววิทยามะเร็ง: การทำแผนที่ของการทำงานใหม่ที่ควบคุมการเจริญเติบโตของเนื้องอกหรือการเพิ่มภูมิคุ้มกัน
- ภูมิคุ้มกันวิทยา: การระบุหน่วยงานกำกับดูแลของการเปิดใช้งาน T-cell, ความเหนื่อยล้าหรือการผลิตไซโตไคน์
- ประสาทวิทยาศาสตร์: การตรวจสอบยีนที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างของเซลล์ประสาทและการทำงาน
- การค้นพบเป้าหมายการค้นพบ: การตรวจสอบความถูกต้องของเป้าหมายการรักษาโดยการสังเกตเอฟเฟกต์ transcriptyptic ดาวน์สตรีมของ re -knockdown
ความท้าทายและการพิจารณา
ในขณะที่ Perturb-seq นั้นทรงพลังมีบางสิ่งที่ต้องจำไว้:
- ความซับซ้อนของข้อมูล: การรวมกันของจังหวะ CRISPR และข้อมูลบทกวีการถอดเสียงต้องใช้เครื่องมือชีวสารสนเทศขั้นสูง
- การออกแบบการทดลอง: ขนาดห้องสมุดจำนวนเซลล์และความลึกการเรียงลำดับจะต้องมีการวางแผนอย่างรอบคอบสำหรับผลลัพธ์ที่มีความหมายทางสถิติ
- ค่าใช้จ่าย: หน้าจอ CRISPR เซลล์ขนาดใหญ่ขนาดใหญ่เกี่ยวข้องกับการจัดลำดับและต้นทุนการทดสอบที่สำคัญ
อนาคตของจีโนมการทำงาน
ในขณะที่เทคโนโลยีเซลล์เดียวยังคงพัฒนาอย่างต่อเนื่องวิธีการต่าง ๆ เช่น Perturb-seq สามารถเข้าถึงได้และปรับขนาดได้มากขึ้น แพลตฟอร์มใหม่และการวิเคราะห์ท่อช่วยลดอุปสรรคในการเข้าถึงทำให้ห้องปฏิบัติการง่ายขึ้นเพื่อรวมฟังก์ชั่นการทำงานที่ใช้ CRISPR ลงในงานวิจัยของพวกเขา
สำหรับนักวิจัยที่มีความสนใจในการสำรวจวิธีการลำดับเซลล์เดียวเช่น Perturb-seq สัมผัสการถอดเสียง และบริการลำดับ RNA จากผู้ให้บริการเช่น Menios Bio นำเสนอเครื่องมือเสริมสำหรับการสร้างโปรไฟล์ที่หลากหลาย